Среда Эндо. Состоит из МПА с добавлением 1% лактозы и обесцвеченного сульфитом натрия основного фуксина (индикатор). Среда Эндо имеет слаборозовый цвет. Используется в диагностике кишечных инфекций для дифференциации бактерий, разлагающих лактозу с образованием кислых продуктов, от бактерий, не обладающих этой способностью. Колонии лактозопозитивных микробов (кишечная палочка) имеют красный цвет вследствие восстановления фуксина. Колонии лактозонегативных микроорганизмов - сальмонелл, шигелл и др. -бесцветны.
К дифференциально-диагностическим средам относятся короткий и развёрнутый пёстрый ряд. Он состоит из сред с углеводами (среды Гисса), МПБ, молока, мясопептонной желатины.
Среды Гисса готовятся на основе пептонной воды, к которой прибавляются химически чистые моно-, ди- или полисахариды (глюкоза, лактоза, крахмал и др.).
Для обнаружения сдвигов рН в результате образования кислот и разложения углевода в среды прибавляют индикатор. При более глубоком расщеплении углеводов образуются газообразные продукты (СО 2 , СН 4 и др.), которые улавливаются при помощи поплавков - маленьких пробирочек, опущенных в среду кверху дном. Среды с углеводами могут готовиться и плотными - с добавлением 0,5-1% агар-агара. Тогда газообразование улавливается по образованию пузырьков (разрывов) в столбике среды.
На МПБ, входящем в пёстрый ряд, обнаруживают продукты, образующиеся при расщеплении аминокислот и пептонов (индол, сероводород). Сероводород обнаруживается путем помещения в МПБ после засева культуры полоски фильтровальной бумаги, пропитанной раствором уксуснокислого свинца. При расщеплении аминокислот, содержащих серу, выделяется сероводород, бумажка чернеет за счёт образования сернистого свинца. Для определения индола можно использовать сложный индикатор. Индол образуется при расщеплении триптофана, и его можно обнаружить при добавлении к культуре, выращенной на МПБ, этого индикатора. При наличии индола МПБ окрашивается в зеленый или синий цвет.
В практических бактериологических лабораториях широко применяют микро- и экспресс-методы для ориентировочного изучения биохимических свойств микроорганизмов. Для этой цели существует множество тест-систем. Наиболее часто используют систему индикаторных бумаг (СИБ). СИБы представляют из себя диски фильтровальной бумаги, пропитанные растворами сахаров или других субстратов в сочетании с индикаторами. Такие диски опускают в пробирку с выросшей в жидкой питательной среде культурой. По изменению цвета диска с субстратом судят о работе фермента. Микро-тест системы для изучения идентификации энтеробактерий представлены одноразовыми пластиковыми контейнерами со средами, содержащими различные субстраты, с добавлением индикаторов. Посев чистой культуры микроорганизмов в такие тест-системы позволяет быстро выявить способность бактерий утилизировать цитраты, глюкозу, сахарозу, выделять аммиак, индол, разлагать мочевину, лизин, фенилаланин и т.д.
Сухие среды. Питательный агар, а также основные дифференциально-диагностические среды выпускаются в настоящее время в виде сухих препаратов, содержащих все необходимые составные части. К таким порошкам нужно добавить только воду и сварить, а затем, после разливки, простерилизовать.
Применяются для разграничения отдельных видов или групп микроорганизмов. Принцип построения этих сред основан на том, что разные виды микроорганизмов различаются между собой по биохимической активности вследствие неодинакового набора ферментов.
В состав ДДС входят:
1. Питательная основа, обеспечивающая размножение микроорганизмов
2. Определенный углевод - лактоза
3. Индикатор, изменение цвета которого свидетельствует о сдвиге pH среды в кислотную сторону, вследствие ферментации соответствующего углевода.
ДДС активно применяются для дифференциации видов микроорганизмов семейства кишечных.
Элективные питательные среды
Предназначены для избирательного выделения и накопления микроорганизмов определенного вида (или группы) из материалов, содержащих разнообразную постороннюю микрофлору. При создании этих сред исходят из биологических особенностей, которые отличают микроорганизмы от большинства других. Например, избирательный рост стафилококков наблюдается при повышенной концентрации соли, холерного вибриона - в щелочной среде.
Разлив сред
1. Агаровых сред в чашки Петри:
а) расплавить на водяной бане, остудить до 45-50ºС с МПА
б) поставить чашку крышкой вверх
в) сосуд до средой взять в правую руку, держа его у огня
г) левой рукой вынуть пробку, зажав ее мизинцем и ладонью
д) обжечь горлышко бутылки со средой и двумя пальцами левой руки слегка приоткрыть крышку
е) ввести под нее горлышко бутыли, не касаясь им края чашки и налить 15-20 мл. среды.
Если посев проводят в день разлива среды, то её необходимо подсушить в термостате 20-30 минут в разобранном виде, открыто стороной вниз. Если посев проводят на следующий день, то чашки не подсушивая заворачивают в ту же бумагу, в которой их стерилизовали и помещают в холодильник.
2. Агаровых среда в пробирки:
а) взять сосуд с расплавленной и остуженной до 45ºС средой
б) левой рукой взять пробирку
в) правой рукой извлечь пробку из пробирки, а левой рукой из сосуда со средой, зажав ее мизинцем и ладонью
г) обжечь края пробирки и сосуда со средой, внести в пробирку 3-5 мл среды
д) вновь обжечь горлышки емкостей, закрыть из пробками
Агаровые среды могут застывать в пробирках в виде:
1. Скошенного столбика
2. Комбинированного столбика
3. Столбика
Для получения скошенного и комбинированного столбика, пробирки с расплавленной агаровой массой укладывают в наклонном положении на специальную подставку, чтобы среда не заходила на 2/3 пробирки, не смачивала пробку. После застывания среды, пробирки ставят вертикально в штатив, дают стечь конденсату вниз. Пользоваться средой без конденсата нельзя. Ее следует снова растопить на водяной бане и скосить.
Мясо-пептонный агар
дифференциально-диагностические среды, специальные питательные среды, используемые для идентификации микроорганизмов, обладающих избирательной биохимической активностью по отношению к определённым веществам. В процессе развития микробы с помощью ферментов расщепляют входящие в состав среды определённые вещества, что устанавливают по изменению среды.
Ряд патогенных микроорганизмов разлагают углеводы, многоатомные спирты с образованием кислот и газов (углекислоты, водорода, метана), что указывает на принадлежность их к определённой группе или виду бактерий. Для установления этих свойств готовят жидкие или полужидкие Д.-д. с. с глюкозой, лактозой, сахарозой, маннозой и др. углеводами, многоатомными спиртами (пёстрый ряд), с индикаторами (Андраде, Гисса), среды с молоком. Ферментативную способность микробов определяют по появлению газа или изменению цвета индикатора. Интенсивность кислотообразования из глюкозы определяют на среде Кларка, образования ацетилметилкарбонала - с помощью реакции Фогеса‑Проскауэра, амилолитическую способность микробов - на крахмальном агаре. Протеолитические свойства микробов определяют на средах, не содержащих глюкозу и глицерин, - мясо-пептонном желатине, свернувшейся лошадиной сыворотке, молочном агаре. Мясо-пептонный желатин засевают путём укола до дна пробирки, инкубируют при t 20-22{{°}}C, а затем определяют степень разжижения желатина. Гемолитическую способность микробов устанавливают путём высева на кровяной агар или бульон с кровью. Для определения редуцирующей активности микробов применяют Д.-д. с. с красителями (метиленовый синий, лакмус, индидокармин, тионин и др.). По мере роста микробов происходит полное или частичное обесцвечивание или изменение цвета красителя. Используют также среды с нитратами, в которых под воздействием ферментов определенных микробов нитраты восстанавливаются в нитриты и далее - в аммиак или свободный азот.
Существуют специальные селективные среды для выращивания анаэробов (Китта-Тароцци среда и др.), идентификации некоторых бактерий кишечной группы, сальмонелл (среды Эндо, Левина, Симмонса, Плоскирева и др.), для определения подвижности микробов, их отношения к кислороду (среда Пешкова) и др. Возбудителя туберкулёза выращивают на специальных яичных средах Петраньяни, Ливенштейна-Йенсена, Гельберга, возбудителей паратуберкулёза - на среде Дюбо-Смита, бруцеллёза - на средах Альбини, Вейбриджа, Корнеевой; возбудителя вибриоза - на среде ГНКИ. Микоплазмы наиболее успешно выделяются и поддерживаются на среде Эдварда и др. специальных средах; лептоспиры - на сывороточных средах Терских, Уленхута, Любашенко, альбуминовой среде ГНКИ. Возбудитель копытной гнили овец растет на мозговых средах с добавлением экстракта копытного рога и серусодержащих аминокислот; грибы - на средах Саоуро, Чапека и др.
Питательной средой в микробиологии называют среды, содержащие различные соединения сложного или простого состава, которые применяются для размножения бактерий или других микроорганизмов в лабораторных или промышленных условиях.
Питательные среды готовят из продуктов животного или растительного происхождения. Большое значение имеет наличие в питательной среде ростовых факторов, которые катализируют метаболические процессы микробной клетки (витамины группы В, никотиновая кислота и др.).
Искусственные среды готовят по определенным рецептам из различных настоев или отваров животного или растительного происхождения с добавлением неорганических солей, углеводов и азотистых веществ.
В бактериологической практике чаще всего используют сухие питательные среды, которые получают на основе достижений современной биотехнологии. Для их приготовления используют экономически рентабельное непищевое сырье: утратившие срок годности кровезаменители (гидролизин-кислотный гидролизат крови животных, аминопептид - ферментативный гидролизат крови; продукты биотехнологии (кормовые дрожжи, кормовой лизин, виноградная мука, белколизин). Сухие питательные среды могут храниться в течение длительного времени, удобны при транспортировке и имеют относительно стандартный состав.
По консистенции питательные среды могут быть жидкими, полужидкими, плотными. Плотные среды готовят путем добавления к жидкой среде 1,5-2% агара, полужидкие - 0,3- 0,7 % агара. Агар представляет собой продукт переработки особого вида морских водорослей, он плавится при температуре 80-86 °С, затвердевает при температуре около 40 °С и в застывшем состоянии придает среде плотность. В некоторых случаях для получения плотных питательных сред используют желатин (10-15%). Ряд естественных питательных сред (свернутая сыворотка крови, свернутый яичный белок) сами по себе являются плотными.
По целевому назначению среды подразделяют на основные, элективные и дифференциально-диагностические.
К основным относятся среды, применяемые для выращивания многих бактерий. Это триптические гидролизаты мясных, рыбных продуктов, крови животных или казеина, из которых готовят жидкую среду - питательный бульон и плотную - питательный агар. Такие среды служат основой для приготовления сложных питательных сред - сахарных, кровяных и др., удовлетворяющих пищевые потребности патогенных бактерий.
Элективные питательные среды предназначены для избирательного выделения и накопления микроорганизмов определенного вида (или определенной группы) из материалов, содержащих разнообразную постороннюю микрофлору. При создании элективных питательных сред исходят из биологических особенностей, которые отличают данные микроорганизмы от большинства других. Например, избирательный рост стафилококков наблюдается при повышенной концентрации хлорида натрия, холерного вибриона - в щелочной среде и т. д.
Дифференциально-диагностические питательные среды применяются для разграничения отдельных видов (или групп) микроорганизмов. Принцип построения этих сред основан на том, что разные виды бактерий различаются между собой по биохимической активности вследствие неодинакового набора ферментов.
Особую группу составляют синтетические и полусинтетические питательные среды . В состав синтетических сред входят химически чистые вещества: аминокислоты, минеральные соли, углеводы, витамины. В полусинтетические среды дополнительно включают пептон, дрожжевой экстракт и другие питательные вещества. Эти среды чаще всего применяют в научно-исследовательской работе и в микробиологической промышленности при получении антибиотиков, вакцин и других препаратов.
В последние годы в целях экономии питательных сред и ускоренной идентификации некоторых микроорганизмов (энтеробактерии, стафилококки, стрептококки и др.) применяются так называемые микротест-системы(МТС). Они представляют собой полистироловые пластины с лунками, в которых содержатся стерильные дифференциально-диагностические среды. Стерилизацию МТС проводят УФ-облучением. Микротест-системы особенно удобны при массовых бактериологических исследованиях в практических лабораториях.
Вопрос №9. Принципы и методы выделения чистых культур бактерий. Характер роста микроорганизмов на жидких и плотных питательных средах.
Чистой культурой называется популяция бактерий одного вида или одной разновидности, выращенная на питательной среде. Многие виды бактерий подразделяют по одному признаку на биологические варианты - биовары . Биовары, различающиеся по биохимическим свойствам, называют хемоварами , по антигенным свойствам - сероварами , по чувствительности к фагу - фаговарами . Культуры микроорганизмов одного и того же вида, или биовара, выделенные из различных источников или в разное время из одного и того же источника, называют штаммами , которые обычно обозначаются номерами или какими-либо символами. Чистые культуры бактерий в диагностических бактериологических лабораториях получают из изолированных колоний, пересевая их петлей в пробирки с твердыми или, реже, жидкими питательными средами.
Колония представляет собой видимое изолированное скопление особей одного вида микроорганизмов, образующееся в результате размножения одной бактериальной клетки на плотной питательной среде (на поверхности или в глубине ее). Колонии бактерий разных видов отличаются друг от друга по своей морфологии, цвету и другим признакам.
Чистую культуру бактерий получают для проведения диагностических исследований - идентификации, которая достигается путем определения морфологических, культуральных, биохимических и других признаков микроорганизма.
Морфологические и тинкториальные признаки бактерий изучают при микроскопическом исследовании мазков, окрашенных разными методами, и нативных препаратов.
Культуральные свойства характеризуются питательными потребностями, условиями и типом роста бактерий на плотных и жидких питательных средах. Они устанавливаются по морфологии колоний и особенностям роста культуры.
Биохимические признаки бактерий определяются набором конститутивных и индуцибельных ферментов, присущих определенному роду, виду, варианту. В бактериологической практике таксономическое значение имеют чаще всего сахаролитические и протеолитические ферменты бактерий, которые определяют на дифференциально-диагностических средах.
При идентификации бактерий до рода и вида обращают внимание на пигменты, окрашивающие колонии и культуральную среду в разнообразные цвета. Например, красный пигмент образуют Serratia marcescens, золотистый пигмент - Staphylococcus aureus (золотистый стафилококк), сине-зеленый пигмент - Pseu-domonas aeruginosa.
Для установления биовара (хемовара, серовара, фаготипа) проводят дополнительные исследования по выялвениб соответствующего маркера – определению фермента, антигена, чувствительности к Фанам.
Методы выделения чистых культур бактерий.
Универсальным инструментом для производства посевов является бактериальная петля. Кроме нее, для посева уколом применяют специальную бактериальную иглу, а для посевов на чашках Петри - металлические или стеклянные шпатели. Для посевов жидких материалов наряду с петлей используют пастеровские и градуированные пипетки. Первые предварительно изготовляют из стерильных легкоплавких стеклянных трубочек, которые вытягивают на пламени в виде капилляров. Конец капилляра сразу же запаивают для сохранения стерильности. У пастеровских и градуированных пипеток широкий конец закрывают ватой, после чего их помещают в специальные пеналы или обертывают бумагой и стерилизуют.
При пересеве бактериальной культуры берут пробирку в левую руку, а правой, обхватив ватную пробку IV и V пальцами, вынимают ее, пронося над пламенем горелки. Удерживая другими пальцами той же руки петлю, набирают ею посевной материал, после чего закрывают пробирку пробкой. Затем в пробирку со скошенным агаром вносят петлю с посевным материалом, опуская ее до конденсата в нижней части среды, и зигзагообразным движением распределяют мате риал по скошенной поверхности агара. Вынув петлю, обжигают край пробирки и закрывают ее пробкой. Петлю стерилизуют в пламени горелки и ставят в штатив. Пробирки с посевами над г писывают, указывая дату посева и характер посевного материала (номер исследования или название культуры).
Посевы «газоном» производят шпателем на питательный агар в чашке Петри. Для этого, приоткрыв левой рукой крышку, петлей или пипеткой наносят посевной материал на поверхность питательного агара. Затем проводят шпатель через пламя горелки, остужают его о внутреннюю сторону крышки и растирают материал по всей поверхности среды. После инкубации посева появляется равномерный сплошной рост бактерий.
Характер роста микроорганизмов на жидких питательных средах:
Бактерии, засеянные в определенный, но не изменяющийся объем жидкой питательной среды, размножаясь, потребляют питательные элементы, что в дальнейшем приводит к истощению питательной среды и прекращению роста бактерий. Культивирование бактерий в такой системе называют периодическим, а культуру – периодической. Если же условия культивирования поддерживаются путем непрерывной подачи свежей питательной среды и оттока такого же объема культуральной жидкости, то такое культивирование называется непрерывным, а культура – непрерывной.
При выращивании бактерий на жидкой питательной среде наблюдается придонный, диффузной или поверхностный (в виде пленки) рост культуры.
Характер роста микроорганизмов на плотных питательных средах:
Бактерии, растущие на плотных питательных средах, образуют изолированные колонии округлой формы с ровными или неровными краями различной консистенции и цвета, зависящего от пигмента бактерий.
Пигмент, растворимые в воде, диффундируют в питательную среду и окрашивают ее, например синегнойная палочка (Pseudomonas aeruginosa) окрашивает среду в синий цвет. Другая группа пигментов нерастворима в воде, но растворима в органических растворителях. Так, колонии «чудесной палочки» имеют кроваво – красный пигмент, растворимый в спирте. И, наконец, существуют пигменты, нерастворимые ни в воде, ни в органических соединениях.
Вид, форму, цвет и другие особенности колоний на плотной питательной среде (культуральные свойства) учитывают при идентификации бактерий, а также отборе колоний для получения чистых культур.
В промышленных условиях при получении биомассы микроорганизмов с целью приготовления антибиотиков, вакцин, диагностических препаратов и эубиотиков культивирование в основном осуществляют в ферментерах при строгом соблюдении оптимальных параметров для роста и размножения культур.
Вопрос №10. Способы получения энергии бактериями (дыхание, брожение). Типы дыхания бактерий.
Дыхание, или биологическое окисление , основано на окислительно-восстановительных реакциях, идущих с образованием АТФ-универсального аккумулятора химической энергии. Энергия необходима микробной клетке для ее жизнедеятельности. При дыхании происходят процессы окисления и восстановления: окисление - отдача донорами (молекулами или атомами) водорода или электронов; восстановление - присоединение водорода или электронов к акцептору. Акцептором водорода или электронов может быть молекулярный кислород (такое дыхание называется аэробным) или нитрат, сульфат, фумарат (такое дыхание называется анаэробным - нитратным, сульфатным, фумаратным).
Анаэробиоз (от греч. аег - воздух + bios - жизнь) - жизнедеятельность, протекающая при отсутствии свободного кислорода. Если донорами и акцепторами водорода являются органические соединения, то такой процесс называется брожением . При брожении происходит ферментативное расщепление органических соединений, преимущественно углеводов, в анаэробных условиях. С учетом конечного продукта расщепления углеводов различают спиртовое, молочнокислое, уксуснокислое и другие виды брожения.
По отношению к молекулярному кислороду бактерии можно разделить на три основные группы: облигатные, т.е. обязательные, аэробы, облигатные анаэробы и факультативные анаэробы.
Типы дыхания бактерий:
· Строгие аэробы. Функционируют в присутствие О 2
· Микроаэрофилы. Нуждаются в О 2 в меньшей степени.
· Факультативные анаэробы. Живут в присутствии О 2 и без негою могут дышать кислородными носителями: сульфаты, карбонаты.
· Облигатные анаэробы. Бактерии, которые бродят. Для них О 2 ядовит.
· Культура – микроорганизмы, выросшие на питательной среде.
· Колония – скопление микробных клеток.
· Чистая культура – микробы одного вида.
· Клон – генетически однородная популяция м/о, выделенная из одной микробной клетки при ее прямой изоляции.
· Штамм – чистая культура микробов выделенная из определенного источника в определенное время.
Исследования бактерий требуют скрупулезной работы с многочисленным оборудованием и инструментарием. Чтобы микроорганизмы в лабораторных условиях максимально быстро размножались и могли поддерживать нормальную жизнедеятельность, используются специальные среды питательные. Их состав и биофизические условия подходят для активного роста бактериальной культуры.
Питательные среды. Микробиология и другие области применения
Колонии бактерий в лабораторных условиях выращиваются на чашках Петри, которые заполнены желеобразным или полужидким содержимым. Это и есть среды питательные, состав и свойства которых максимально приближены к естественным для качественного роста культуры.
Например, такая элективная среда пригодна только для размножения кишечной палочки. Тогда из посева множества бактерий на чашке Петри мы увидим только колонии той самой кишечной палочки и никакие больше. Прежде чем приступать к работе, необходимо хорошо знать метаболизм исследуемой бактерии, чтобы удачно ее отобрать из смеси других видов.
Твердые, полужидкие и жидкие питательные среды
Бактерии могут выращиваться не только на твердых субстратах. Среды питательные отличаются между собой по агрегатному состоянию, что зависит от состава при изготовлении. Изначально все они имеют жидкую консистенцию, а при добавлении желатина или агара в определенном процентном соотношении смесь застывает.
Жидкие питательные среды обычно находятся в пробирках. Если появляется необходимость выращивать бактерии в таких условиях, добавляют раствор с пробой культуры и ждут 2-3 суток. Результат может быть различным: выпадает осадок, появляется пленка, плавают мелкие хлопья или образуется мутный раствор.
Плотная питательная среда часто используется в микробиологическом исследовании для изучения свойств колоний бактерий. Такие среды всегда прозрачные или полупрозрачные, чтобы была возможность правильно определить цвет и форму культуры микроорганизмов.
Приготовление питательных сред
Очень просто готовятся такие субстраты, как мясопептонные смеси на основе бульона, желатина или агара. Если нужно сделать твердый или полужидкий субстрат, в жидкость добавляют соответственно 2-3% или 0,2-0,3% желатина или агара. Они играют главную роль в затвердевании смеси, но никак не являются источником питательных веществ. Таким образом, и получают среды питательные, которые пригодны для роста бактериальной культуры.